restrizione

problema:come riconoscere i batteri che contengono plasmidi ricombinanti?
per ottenere i plasmidi ricombinanti si devono mettere insieme nello
stesso ambiente plasmidi trattati con enzimi di restrizione,segmenti
di DNA ottenuti trattando il DNA estraneo con gli stessi enzimi di
restrizione,enzima ligasi per ottenere il legame tra le estremità coesive
complementari plasmidiali ed estranee
non tutti i plasmidi sono ricombinanti
non tutti i batteri hanno acquistato i plasmidi

un plasmide può contenere geni per la resistenza agli antibiotici
trattando una coltura batterica con antibiotici adatti si può selezionare
una popolazione resistente da una popolazione sensibile e resistente
oppure riconoscere se il plasmide contiene o meno il gene per la
resistenza a quell'antibiotico

i batteri che acquistano plasmidi(dotati di gene per resistenza alla
ampicillina),se trattati con l'antibiotico,rimangono vitali:i batteri
senza plasmidi vengono selezionati e scompaiono
per distinguere tra i batteri con plasmidi quelli ricombinanti si sfrutta
una seconda selezione:i plasmidi possono contenere due zone,geni,che
codificano per due antibiotici diversi:tetraciclina e ampicillina
trattando con certi enzimi di restrizione i plasmidi,viene neutralizzato
il gene per la tetraciclina,generando due estremità coesive ove possono
legarsi frammenti di DNA estraneo originando così plasmidi ricombinanti
introducendo nella coltura batterica antibiotico ampicillina vengono
selezionati batteri privi di plasmidi
introducendo nelle colture rimaste vitali antibiotico tetraciclina,
restano vitali solo i batteri che hanno ancora il gene per la tetraciclina,
quindi non ricombinanti,mentre scompaiono quelli ricombinanti

in conclusione:
dalla coltura batterica vengono eliminati batteri senza plasmidi usando
ampicillina

dalla coltura rimasta vitale si separano singoli batteri e si ottengono
colture di cloni batterici
si sdoppia ogni coltura:una rimane come deposito,l'altra viene trattata
con tetraciclina:si prende nota delle colture ove i batteri muoiono:
sono le colture dei batteri ricombinanti

problema:si tratta ora di sapere quale gene è presente nei plasmidi
dei batteri ricombinanti,essendo molto diversi i tipi di frammenti che
possono essere stati ottenuti con gli enzini di restrizione e quindi
integrati nei plasmidi batterici

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